牛津纳米孔测序技术


概观

样品的质量要求

样品制备方法

测序文库的选择

用户准备的库

测序结果文件

 

概观


牛津纳米孔采用独特的测序技术,其允许核酸分子与长度,范围远高于100000碱基测序,虽然典型的基因组DNA样品产生的阅读长度的是平均从10,000到20,000碱基对。而基因组DNA测序经常在牛津纳米孔设备,大型PCR产物,cDNA和RNA也可以测序。此外,有可能确定在基因组DNA中CpG位点的胞嘧啶的甲基化的情况下直接输入DNA的重亚硫酸盐处理。

牛津纳米孔测序利用,在一个膜位于工程改造的形成蛋白质 - 蛋白质的。的电荷被通过膜施加,并且离子流通过所述孔和产生电流。当DNA或RNA的单链穿过所述孔,所述电电流根据是所述孔内部的碱基改变。作为DNA或RNA继续穿过所述孔,所述电流的变化,和所述核酸的序列可以基于在一个单一的孔观察到的电流信号来确定。因为序列读取的长度不依赖于聚合酶,读数十千碱基的长度是与基因组DNA共同。产量为DNA和RNA两者/ cDNA的测序非常依赖于样品的质量。  用于DNA,10英镑(最多20英镑)的产率可以以良好的质量的DNA来获得,也可以是低到5英镑与中等质量的DNA。对于成绩单测序,几百万读取可以用的cDNA-PCR和基因直接测序试剂盒获得的,高达一百万读取可以通过直接RNA测序试剂盒获得。

 

样品的质量要求


因为牛津纳米孔测序技术依赖的工程改造的成孔蛋白,任何不利地影响该孔可以潜在地禁用的孔,并从生成序列停止的孔时。单个流动池包含高达2400个孔。是从一个测序运行得到的序列的量在很大程度上取决于输入的DNA或RNA的质量。因此,至关重要的是,DNA具有260/280比率为1.8至2.0和二百三十零分之二百六十〇比为2.0〜2.2。对于RNA,260/280比必须〜2.0,并且二百三十零分之二百六比率必须为2.0〜2.2。不符合这些要求的DNA和RNA样本可能含有污染物,会产生不利影响测序产量。

另外,对于基因组DNA样品,至关重要的是,高分子量的DNA进行测序。在凝胶图像剪切的任何指示还表明,有在样品中广泛切口。如纳米孔测序简单地包括退绕的双链DNA并通过单链通过蛋白孔,一旦遇到切口,单链穿过所述孔被破坏,并且仅将获得短读。基因组学的核心用来基因组DNA文库的协议,其包括切口修复步骤,但广泛切口不能被完全固定。

各种牛津纳米孔库中的其他样品要求在描述我们 纳米孔样品要求页.

 

样品制备方法


的,因为对于纳米孔测序,许多传统的纯化方法(苯酚 - 氯仿,硫氰酸胍)优质的基因组DNA的要求将不能产生可接受的DNA样本。  旋转柱为基础的方法一般气馁,因为它们可以导致物理上受损的DNA,这将产生非常短的读取和低的产率,而不应被用于基因组DNA制备。  已上报工作很好的方法可以依赖样品的来源。 QIAGEN基因组为基础的尖端的方法已经与动物组织,血液样品,动物细胞培养物,革兰氏阴性细菌培养,革兰氏阳性细菌培养运作良好。凯杰血液和细胞培养试剂盒具有与动物细胞培养,鱼组织和血液样本的工作。 Qiagen公司的DNeasy POWERMAX土壤试剂盒已经产生了从土壤和细菌的细胞培养物的高质量DNA。从circulomics所述nanobind CBB DNA试剂盒适用于动物细胞培养物,血液样品和细菌培养物。在nanobind植物细胞核大DNA试剂盒已被认为是最有可能从会产生高产量的纳米孔测序运行工厂生产出高质量的DNA的方法。 circulomics也具有短的读消除试剂盒,其可以从一个DNA样品耗尽较短片段和增加的长读测序运行的N50。 revolugen的自旋基于列的试剂盒,据说可以隔离来自细菌和动物细胞样品高分子量DNA中。

高分子量(HMW)基因组DNA样本必须非常小心。隔离和所有其他的操作条件时,HMW DNA不能涡旋,并且任何移液必须使用大口径的提示。如果宽孔移液管尖端没有被购买,它是可以接受的用新的剃刀刀片以切割尖端关闭常规移液管尖端的。所得到的移液管尖端开口应为约3毫米的直径。所有的移液动作应缓慢进行。通过反复吹打样品混合将剪切样品。另外,被推荐用于HMW DNA使用低的DNA结合的微量离心管。

非基因组DNA的样品,如扩增子是小于20千碱基可以根据常规分子生物学实践来处理,但是样品含有较长分子应与需要防止DNA的物理剪切的注意事项来处理。

对RNA样品,典型的旋转柱协议是用于生产高质量的样本进行纳米孔测序是可接受的。 

请联系基因组学的核心(gtsf@msu.edu)有关样品提取协议的建议。

 

测序文库的选择

365bet体育基因组学核心提供了以下类型的样本库准备。

库套件名称 纳米孔套件ID 测序目标
1D结扎测序试剂盒 lsk109 基因组DNA
1D连接测序试剂盒(无tagmentation) lsk108 长扩增子和用户条形码的扩增子
快速条形码试剂盒(最多12个样品) rbk004 复用基因组DNA(基因组小)
直接RNA测序试剂盒 rna002 全长RNA
的cDNA-PCR测序试剂盒(无条形码) pcs109 全长cDNA
的cDNA-PCR测序试剂盒与条形码(最多12个样品) pcs109,pbk004 复用全长cDNA
直接基因测序试剂盒 dcs109 全长cDNA

看到我们的 定价页 关于文库制备和流动池的定价,并看到我们的信息 纳米孔抽样送检要求页 之前提交样品。

 

用户准备的库


研究人员想自己准备库,用于纳米孔测序可以运行在MSU基因组学核心的图书馆谁。在这种情况下,研究者将支付流通池。然而,由于纳米孔库可能完全不存放在通风良好,有必要提交的任何库,以确保有在gridion运行您的库中可用插槽之前与基因组学核心来协调。在gtsf@msu.edu写信给我们,以便我们可以讨论你的测序需求。

 

测序结果文件

基因组学的核心将返回fast5和的fastq数据文件的所有纳米孔测序运行。 fast5文件是牛津纳米孔的版本的 HDF5文件格式。 fast5文件包含所有rebasecall数据所需的原始信号数据的,如果你选择这样做。在返回给你的fastq文件是使用纳米孔从最新basecalling软件basecalling的fast5文件的结果。还将提供用于生产你的序列结果的所有软件的摘要。