牛津纳米孔测序技术


概观

样品的质量要求

样品制备方法

测序文库的选择

用户准备的库

测序结果文件

 

概观


牛津纳米孔使用一个唯一的测序技术,其允许核酸分子的测序与长度100000 bp的基因组DNA样本上述范围很好,虽然典型的产生读取长度为10,000至平均即20000个碱基。而基因组DNA上的牛津通常纳米孔测序仪,大的PCR产物,RNA和cDNA也可以测序。此外,有可能确定在基因组DNA中CpG位点的胞嘧啶的甲基化,而无需直接输入DNA的重亚硫酸盐处理。

牛津纳米孔测序利用经工程改造的蛋白质 - 蛋白质形成坐落在一个膜的。的电荷被通过膜施加,并且离子流通过所述孔和产生电流。当DNA或RNA的单链穿过所述孔,所述电流被改变为碱根据这是孔隙内部。作为DNA或RNA继续穿过所述孔,所述电流的变化,和所述核酸的序列可以基于在单个孔中的观察到的电流信号来确定。因为序列读取的长度不依赖于聚合酶,读数十千碱基的基因组DNA的长度是共同拥有。二者的产率对DNA和RNA / cDNA的测序非常依赖于样品的质量。  对于DNA,10 GBP(最多20 GBP)的产率可以以优良的品质,但DNA来获得可能低至5 GBP DNA经中等质量。对转录物测序,可以是几百万读取得到的cDNA-PCR和直接测序的cDNA的试剂盒,以及高达百万读取可以通过直接RNA测序试剂盒而获得。

 

样品的质量要求


由于纳米孔测序技术牛津凭借一个设计成孔蛋白时,有不利影响任何东西可以和停止生成的先后顺序禁用潜在孔孔孔。单个流动池包含高达2400个孔。即从一个测序运行获得的序列的量依赖于质量很大程度上输入DNA或RNA。因此,至关重要的是,DNA具有260/280比值为1.8〜2.0和二百三十分之二百六十〇比为2.0〜2.2。对于RNA,该比率260/280必须〜2.0,并且二百三十〇分之二百六十〇比率必须为2.0〜2.2。 RNA和DNA的样品不符合这些要求很可能会含有污染物的不利影响测序产量。

另外,对于基因组DNA样品,它是被用于测序提交必不可少分子量高的DNA。在凝胶图像当前剪切的任何指示表明,有在样品中广泛切口。涉及纳米孔测序简单地退绕双链DNA和单链穿过蛋白孔,只要尼克遇到,单链穿过所述孔被破坏,只有很短的读出将被获得。基因组学的核心用于基因组DNA文库的协议包括一个切口修复步骤,但不能完全广泛切口被固定。

各种样品库的附加要求是通过纳米孔牛津为了我们的 纳米孔样品要求页.

 

样品制备方法


因为对于高质量的基因组DNA的要求为纳米孔测序的,许多传统的纯化方法(苯酚 - 氯仿,硫氰酸胍)将不能产生可接受的DNA样本。  旋转柱为基础的方法一般,因为它们可以导致物理损坏的DNA会产生非常短的读取和低的产率和可用于不应该基因组DNA制备气馁。  已报告工作以及方法可以依赖样品的来源。基于有无Qiagen公司的基因组尖端的方法工作良好随着动物组织,血液样品,动物细胞培养物,革兰氏阴性细菌培养,革兰氏阳性细菌培养。 QIAGEN血液和细胞培养试剂盒具有曾与动物细胞培养,鱼组织和血液样本。 Qiagen公司的DNeasy土壤的PowerMax试剂盒已经产生了从土壤和细菌的细胞培养物的高质量DNA。 nanobind从circulomics的CBB DNA试剂盒适用于动物细胞培养,血液样品和细菌培养物。 nanobind植物细胞核大DNA试剂盒已经-被发现是该方法最有可能从植物将产生高产纳米孔测序运行生产出高品质的DNA。 circulomics还具有短读消除试剂盒,其可以从一个DNA样品耗尽较短片段和增加的长读测序运行的N50。 revolugen具有一个基于自旋柱试剂盒可以在高分子量据说分离DNA来自细菌和动物细胞样品。

高分子量(HMW)的基因组DNA样品,必须非常小心处理。在隔离和所有其他的处理条件,HMW DNA不能涡旋,并且任何移液必须使用大口径的提示。如果大口径的枪头尚未购买的,是可以接受的一个新的刀片定期切断枪头尖。移液管尖端开口所得应为〜3毫米的直径。应缓慢进行的所有移液操作。通过吸取样品将剪切重复样品混合。另外,被推荐用于HMW DNA使用低DNA结合的微量离心管。

这样的非基因组DNA样品的扩增子是作为可以小于20 kbp的处理ACCORDING分子生物学实践来调节,但包含样品应处理较长分子必要的预防措施,以DNA的防止物理剪切。

对RNA样品,典型的旋转柱协议是用于生产高质量的样本进行纳米孔测序是可接受的。 

请联络有关准备样品提取协议建议的基因组学核心(gtsf@msu.edu)。

 

测序文库的选择

365bet体育基因组学的核心库提供了以下准备工作类型的样品。

套件库名 纳米孔ID套件 测序目标
1D结扎测序试剂盒 lsk109 基因组DNA
1D连接测序试剂盒(无tagmentation) lsk108 长扩增子和用户条形码的扩增子
条形编码快速试剂盒(最多12个样品) rbk004 复用基因组DNA(基因组小)
直接RNA测序试剂盒 rna002 RNA全长
的cDNA-PCR测序试剂盒(未条形编码) pcs109 全长cDNA
的cDNA-PCR测序试剂盒随着条形码(最多12个样品) pcs109,pbk004 多路全长cDNA
直接的cDNA测序试剂盒 dcs109 全长cDNA

看到我们的 定价页 关于文库制备和流细胞定价信息,并看到我们的 纳米孔抽样送检要求页 之前提交样品。

 

用户准备的库


研究人员想自己准备库,用于纳米孔测序文库可以在MSU那些基因组学核心运行。在这种情况下,研究人员将支付流通池。然而,由于纳米孔可以不存储以及图书馆,有必要协调与基因组学核心之前的任何库提交,以确保有在gridion运行您的库中可用插槽。在gtsf@msu.edu写信给我们,让我们可以讨论你的那测序需求。

 

测序结果文件

基因组学的核心将返回快5和FASTQ数据文件的所有纳米孔测序运行。快5个文件是牛津纳米孔的版本的 HDF5文件格式。快5个文件包含所有rebasecall数据所需的原始信号数据的,如果你选择这样做。这FASTQ返回文件复制到您是使用纳米孔从最新的软件basecalling快速5 basecalling文件的结果。所有用于生产的软件的摘要是你的序列结果将还提供。